애기장대를 이용한 GUS assay 과정과 필요한 용액에 대한 설명

Explanation of GUS assay procedure and solution required using Arabidopsis thaliana

 

<실험 과정>

1. Collect tissue in microcentrifuge tubes or glass scintillation vials and place in cold 90% acetone on ice. Keep on ice until all samples are harvested.

 

애기장대의 잎과 꽃, 뿌리를 이용한 GUS assay 경험에 비춰봤을 때,

glass scintillation vial을 사용하는 것이 더 편했던 것 같다.

 

만약, 뿌리를 이용한 실험 계획을 하고 있다면,

일반적으로 MS agar plate에서 자란 식물체를 이용하기 때문에 문제가 없지만,

흙에서 키운 식물을 대상으로 갑작스럽게 GUS assay를 계획한다면,

흙은 완벽하게 물로 씻은 다음 sampling 하는 것이 마지막 단계에서 현미경 사진을 찍을 때,

훨씬 나은 이미지를 얻을 수 있다.

 

또한, 하나의 vial에 하나의 뿌리를 샘플링 하는 것을 추천한다.

그 이유는, 뿌리가 서로 얽혀서 조직이 찢어지는 경우를 방지하기 위해서이다.

 

2. When all samples have been harvested, incubate them for 20 minutes at room temperature. Meanwhile, prepare staining buffer, without X-Gluc, using prechilled solutions and store on ice.

 

필요한 sample을 vial에 담고, 그 동안 실험에 필요한 용액을 만든다.

 

3. Wash the samples in staining buffer without X-Gluc on ice.

 

모든 과정의 샘플링이 끝나고, 최소 20여분 이상 acetone에 샘플이 보관되었다면,

acetone을 버리고, X-Gluc이 들어가지 않은 buffer를 첨가한다.

 

4. Prepare staining solution by adding X-Gluc stock solution to staining buffer to a final concentration of 0.5㎎/㎖.

 

Staining solution을 만들 때, 가장 중요한 것은Potassium ferricyanide와Potassium ferrocyanide의 농도

 

일반적으로, final concentration 1mM solution을 시작으로 expression pattern 확인하는 것이 좋다.

 

낮은 농도일수록 specific한 pattern을 찾는 것은 어렵지만, 상대적으로 쉽게 발현 유무를 확인하는 것이 가능하기 때문

 

만약, 1mM에서 strong and blur expression을 보여준다면,

3mM에서 5mM까지 농도를 올려서 specific pattern을 확인하는 식으로 진행한다.

 

5. Remove staining buffer from samples and add staining solution, with X-Gluc. Keep on the ice.

 

6. Infiltrate the samples under vacuum for 15-20 minutes.

Release the vacuum slowly. If samples do not sink, repeat vacuum treatment.

 

Staining solution을 담은 vial의 뚜껑을 살짝 열고, vacuum이 연결된 incubator에 넣은 후, 

충분한 vacuum을 걸어주도록 한다. 충분하다는 의미는 vacuum 이후, 샘플이 바닥에 가라앉는 경우를 말한다.

이는 vacuum 과정을 통해서, solution이 sample 안으로 충분하게 들어갔다는 것을 의미한다.

 

7. Incubate typically overnight at room temperature or 37℃.

 

경험상, 37도 incubator에서 vacuum을 overnight 걸어줬을 경우에 GUS는 문제없이 발현되는 것을 관찰할 수 있었다.

 

8. Remove staining solution, and subject the samples to an ethanol series : 20%, 35%, 50% ethanol at room temperature for 30 minutes each.

 

9. Add 70% ethanol.

 

11. Examine the tissue under a dissecting microscope.

 

<실험에 사용되는 용액>

 

․ 0.5M Sodium Phosphate Buffer

1M 50㎖ Sodium Phosphate monobasic (NaH2PO4, F.W. 119.98)

: 작은 비커에 stir bar를 넣고, 40㎖ D.W를 넣는다. 그리고, NaH2PO4를 6.0g을 넣은 후,

완전히 녹은 다음, 모든 용액을 메스실린더로 옮겨서 D.W를 이용해서, 50㎖을 맞춘다.

 

1M 50㎖ Sodium Phosphate dibasic (Na2HPO4, F.W. 141.96)

: 작은 비커에 stir bar를 넣고, 40㎖ D.W를 넣는다. 그리고, Na2HPO4를 7.1g을 넣은 후,

완전히 녹은 다음, 모든 용액을 메스실린더로 옮겨서 D.W를 이용해서, 50㎖을 맞춘다.

 

0.5M Sodium Phosphate Buffer를 만들기 위해서,

1M Na2HPO4 30.5㎖에 1M NaH2PO4 19.5㎖을 넣고, D.W를 100㎖까지 채우면,

최종적으로 0.5M Sodium Phosphate Buffer (pH7.0)를 만들 수 있다.

 

* Phosphate는 Buffer로써, pH가 중요하기 때문에, 정확한 양을 반드시 넣어야 한다.

 

․ 50mM K3F3(CN)6

50mM Potassium Ferricyanide (K3Fe(CN)6, F.W. 329.26)

: 50㎖ Falcon tube에 D.W 40㎖을 넣고, 0.82g의 Potassium Ferricyanide를 넣고,

vigorously shaking을 해준다. 완전히 녹은 다음, D.W를 사용하여 50㎖을 맞춘다.

 

50mM Potassium Ferrocyanide (C6FeK4N6․3H2O, F.W. 422.41)

: 50㎖ Falcon tube에 D.W 40㎖을 넣고, 1.06g의 Potassium Ferrocyanide를 넣고,

vigorously shaking을 해준다. 완전히 녹은 다음, D.W를 사용하여 50㎖을 맞춘다.

 

* 전자의 이동에 관여하는 산화 ․ 환원제로써 쓰이기 때문에, 반드시 어두운 곳에 보관해야한다.

 

․ 0.5M EDTA (pH8.0)

EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid disodium dehydrate, C10H14N2O8Na2․2H20)로써,

2개의 Sodium이 붙은 것을 사용한다.

18.61g의 EDTA를 약 70㎖의 D.W가 담긴 비커에 넣는다 (EDTA는 pH가 8.0으로 되기 전 절대 녹지 않는다.)

1㎖ 파이펫을 사용하여 10N NaOH 용액을 약 3㎖ 넣어준 후, pH를 확인한다.

다시 적당히 10N NaOH를 넣어줌으로써, pH를 8.0으로 맞춰야 한다.

최종적으로 메스실린더에서 D.W를 사용하여 100㎖이 되도록 한다.

 

․ X-Gluc

X-Gluc 100㎎을 DMSO 10㎖에 완전히 녹여서, 1㎖씩 분주하여 놓는다.

 

<Example> Lee et al. (2014) Developmental Biology 386 (2014) 12-24